2結果與分析

2.1生物表面活性劑產生菌的篩選

經富集分離共得到49株細菌，初步篩選出14株生長較好的目的菌株接種于發酵培養基。在微生物采油過程中，表面活性劑和有機酸可以把原油從巖層中剝離下來，提高原油流動性。因此，以發酵過程中發酵液的pH和表面張力的降低為指標，對初篩得到的菌株進行復篩，同時分析所產生物表面活性劑的類型，結果見表1。

表1初篩菌株的發酵測定結果

由表1可知，菌株29#、30#、31#、37#、47#的發酵液的表面張力值及pH較低。選取該5株菌進行分析，菌株29#、30#、31#發酵液的表面張力及pH比較接近，產生的生物表面活性劑均為糖脂，在原油平板上的菌落均為熒光綠色，種子液和發酵液均為熒光綠色，細胞均為桿狀且大小相同。因此，判斷該3株菌為同一菌種。復篩得到的菌株為31#、37#、47#。

2.2生物表面活性劑產生菌的生理生化特性

對篩選所得菌株進行常規生理生化特性實驗，結果如表2所示。根據表2所示結果和《伯杰氏(Berge)菌種鑒定手冊》的描述，可鑒定菌株31#為假單孢屬，菌株37#、47#均為芽孢桿菌屬。

表2生物表面活性劑產生菌的生理生化特性

2.3生物表面活性劑產生菌的生長特性

2.3.1菌株31#的生長特性

菌株31#的生長特性如圖1所示。在發酵前48 h，菌株31#細胞疏水性呈上升趨勢，菌體密度逐步增長，發酵液的表面張力下降。表明較強的細胞疏水性能增加菌體對疏水性有機物的吸附，從而增加菌體與有機物的接觸機會，增強對有機物的利用能力，導致菌體大量生長并產生大量的生物表面活性物質，使發酵液的表面張力大幅度下降，產生的生物表面活性物質通過改變吸附界面的特性來調節細胞與界面之間的親和力，進一步促進微生物細胞對烴類化合物的附著和烴類化合物穿透細胞膜間隙。在發酵48～84 h期間，菌體生長進入衰亡期，細胞疏水性下降，發酵液的表面張力呈下降趨勢，這是部分菌體自溶釋放出細胞內的生物表面活性物質的結果。在發酵84～108 h期間，細胞疏水性呈下降趨勢，發酵液的表面張力隨菌體密度增大而增大，表明菌體攝取烴類化合物能力降低，利用發酵液中積累的生物表面活性劑呈現二次生長。在發酵108～120 h期間，細胞疏水性上升，表面張力下降。由于31#為革蘭氏陰性菌，細胞外壁中存在與其疏水性密切相關的脂多糖，發酵液中大量積累的生物表面活性劑導致細胞壁中脂多糖大量流失，從而引起細胞疏水性增大。

圖1菌株31#的好氧培養過程曲線

2.3.2菌株37#的生長特性

菌株37#的生長特性如圖2所示。在發酵過程中，細胞疏水性總體呈上升趨勢。發酵24 h時，細胞疏水性大于1，菌體密度隨細胞疏水性的增大而增大。發酵36 h時，發酵液的表面張力降低，這是因為烴類的難溶性使得微生物在攝取烴類生長過程中往往伴隨著生物表面活性劑的生成，其主要作用是使烴類在水溶液中有效擴散，并滲入細胞內部被同化分解，菌體能夠更好地利用烴類碳源生長，菌體密度上升。在發酵48～84 h期間，菌體生長進入穩定期，菌體密度保持不變。在發酵84～96 h期間，菌體密度上升，細胞出現二次生長。這是由于液體石蠟是一種混合物，菌體首先攝取較易利用的10個碳以上的長鏈烷烴，然后再利用其他鏈長的烷烴進行生長，同時因為細胞疏水性上升，細胞利用液體石蠟的能力增強，從而產生大量的生物表面活性物質，使發酵液的表面張力下降。在發酵96～120 h期間，細胞疏水性的降低，菌體密度降低，菌體生長進入衰亡期，發酵液的表面張力上升。

圖2菌株37#的好氧培養過程曲線

2.3.3菌株47#的生長特性

菌株47#的生長特性如圖3所示。在發酵前48 h，菌體密度顯著增長，細胞疏水性增大，發酵液的表面張力降低。在發酵60～72 h期間，菌體密度減小，細胞疏水性降低，發酵液表面張力降低，菌體生長進入衰亡期。在發酵72～84 h期間，菌體密度增加，細胞出現二次生長，產生大量的生物表面活性物質，使發酵液的表面張力大幅下降。在發酵84～120 h期間，菌體密度降低，發酵液的表面張力在保持一段時間的基本穩定后升高。表明菌體在利用烴類生長過程中，產生了生物表面活性劑。生物表面活性劑的產生降低了油水界面張力，使烷烴得以有效擴散，增大油水界面面積，從而便于細胞與較大油滴之間的直接接觸，同時使細胞的疏水性變大，導致細胞親油，從而有利于菌對烴類的利用。

圖3菌株47#的好氧培養過程曲線

2.4生物表面活性劑的化學組分分析

將菌株31#、37#和47#于30℃培養后，對發酵液萃取所得生物表面活性劑粗制品進行硅膠薄層層析，結果如圖4所示。將萃取所得生物表面活性劑粗制品進行酸解，硅膠薄層層析結果如圖5所示。

圖4的層析結果顯棕色，說明菌株31#、37#和47#所產的生物表面活性劑均為糖脂。由圖5可知，菌株31#、37#和47#所產的生物表面活性劑經酸解后顯棕色斑點，且Rf值與鼠李糖的Rf值相同，說明菌株31#、37#和47#所產的生物表面活性劑的糖基均為鼠李糖。

圖4生物表面活性劑粗品的TLC圖譜

圖5生物表面活性劑酸解后的TLC圖譜

3結論

通過對發酵液表面張力及pH的測定，篩選出3株生物表面活性劑產生菌，且所產的生物表面活性劑均為鼠李糖脂；經生理生化鑒定，菌株31#為假單胞菌屬，菌株37#、47#為芽孢桿菌屬；通過對所篩菌株的生長特性的研究，說明菌體密度、細胞疏水性、發酵液的pH及表面張力之間密切相關，相互制約。在以液體石蠟為唯一碳源培養時，菌株31#的發酵液表面張力下降最多，且表現出的細胞疏水性最強，發酵液表面張力下降到49.47 mN/m，細胞疏水性為3.09%。較強的細胞疏水性有利于菌體對疏水性基質的利用，從而導致菌體密度的增長及發酵液表面張力的下降，這對微生物開采稠油十分有利。

生物表面活性劑產生菌菌體密度、細胞疏水性與發酵液pH及表面張力的關系（一）

生物表面活性劑產生菌菌體密度、細胞疏水性與發酵液pH及表面張力的關系（二）