摘要：為了研究胞質(zhì)分裂過程中子細(xì)胞表面張力與細(xì)胞間橋變形之間的聯(lián)系，采用微管吸吮實(shí)驗(yàn)測定了正常大鼠腎上皮細(xì)胞(NRK)在細(xì)胞松弛素D(即CD)或blebbistatin作用下細(xì)胞表面張力的變化，并且采用局部施加CD的方法分析了兩極子細(xì)胞表面張力非平衡狀態(tài)下細(xì)胞間橋的變形曲線。研究結(jié)果認(rèn)為，CD和blebbistatin均可以大幅降低細(xì)胞表面張力；整體施加blebbistatin抑制細(xì)胞主動(dòng)性收縮會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間橋變形完全受到子細(xì)胞表面張力的調(diào)控，細(xì)胞間橋變形過程反映出細(xì)胞調(diào)節(jié)整體表面張力的進(jìn)程。

動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)分裂過程伴隨一系列精巧而又相對(duì)簡單的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。首先，細(xì)胞變圓拉長；隨后在赤道板形成分裂溝并開始收縮，兩極子細(xì)胞中間出現(xiàn)細(xì)胞間橋；最后，細(xì)胞間橋變細(xì)、斷裂，生成兩個(gè)子細(xì)胞。胞質(zhì)分裂是一個(gè)典型的力學(xué)變形過程，與細(xì)胞皮層力學(xué)特性的改變關(guān)系緊密，細(xì)胞間橋變形的過程由分裂溝主動(dòng)收縮和細(xì)胞各部分表面張力協(xié)調(diào)控制。

細(xì)胞表面張力是細(xì)胞皮層力學(xué)的一個(gè)重要參數(shù)，可能是肌動(dòng)—肌球蛋白相互作用的結(jié)果。研究表明：完整的肌動(dòng)蛋白骨架系統(tǒng)對(duì)于張力的產(chǎn)生必不可少，肌球蛋白II突變的黏菌細(xì)胞表面張力較正常黏菌細(xì)胞降低70%。因此，細(xì)胞表面張力成為衡量肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白動(dòng)力學(xué)變化的一個(gè)重要指標(biāo)，例如肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的濃度分布，肌動(dòng)蛋白纖維排列以及肌球蛋白輕鏈磷酸化激活等。胞質(zhì)分裂過程中，極區(qū)子細(xì)胞的表面張力與細(xì)胞間橋變形的聯(lián)系是胞質(zhì)分裂動(dòng)力學(xué)的重要研究對(duì)象，對(duì)探索胞質(zhì)分裂的機(jī)制具有積極作用。

本文利用雙微管局部加藥手段通過施加細(xì)胞松弛素D抑制單側(cè)極區(qū)子細(xì)胞皮層肌動(dòng)蛋白的裝配從而改變子細(xì)胞表面張力。實(shí)驗(yàn)中采用肌球蛋白II的ATP酶活性抑制劑blebbistatin抑制細(xì)胞的主性動(dòng)收縮，在對(duì)比不同驅(qū)動(dòng)力作用下細(xì)胞分裂溝間橋變形的基礎(chǔ)上，分析了極區(qū)皮層表面張力在不同收縮力狀態(tài)下對(duì)變形過程調(diào)控的差異。通過細(xì)胞間橋變形的趨勢，研究和分析了子細(xì)胞表面張力與胞質(zhì)分裂細(xì)胞間橋變形的聯(lián)系。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

正常大鼠腎上皮細(xì)胞(Normal rat kidney epithelial cells，以下簡稱NRK)購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)中，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清(四季青公司)。在體積分?jǐn)?shù)5%的CO?、37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，待用。

1.2整體和局部抑制劑處理

對(duì)數(shù)生長期的NRK細(xì)胞經(jīng)過質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化5 min后輕輕吹打至懸浮。分別采用抑制肌動(dòng)蛋白聚合的2μmol/L CD、抑制肌球蛋白II的ATP酶活性抑制劑30μmol/L blebbistatin處理細(xì)胞15 min。用沒有加入骨架蛋白抑制劑的細(xì)胞作為對(duì)照組。

先將(—)-blebbistain對(duì)映體(Sigma公司)溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配置成10 mmol/L的blebbistatin溶液，再加入三蒸水配成5 mmol/L儲(chǔ)存液，—20℃保存。使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋至終濃度為30μmol/L，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.3%的DMSO。利用blebbistatin處理細(xì)胞15～20 min后開始局部施加抑制劑。將CD(Sigma公司)配成100μmol/L的儲(chǔ)存液，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.5%的DMSO，—20℃保存。使用時(shí)用含0.5 g/L羅丹明熒光素(Sigma公司)的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，使用濃度為5μmol/L，約含體積分?jǐn)?shù)0.02%的DMSO。

將抑制劑注入加藥微管，加藥微管直徑約3μm，吸藥管直徑約30μm，兩管相距約30μm。通過氣泵調(diào)節(jié)壓力，控制藥物作用范圍直徑約15μm。加藥管靠近子細(xì)胞一端極區(qū)，以避免加入的抑制劑流入分裂溝處。加入CD的范圍和濃度變化可以通過羅丹明熒光素顯示，熒光強(qiáng)度的變化代表抑制劑作用濃度梯度，施加的抑制劑在距離中心15μm以外的范圍濃度很低，見圖1。

圖1局部施加抑制劑的范圍和濃度變化

1.3細(xì)胞表面張力的測定

采用芬蘭Kibron公司生產(chǎn)的Delta-8全自動(dòng)高通量表面張力儀對(duì)細(xì)胞膜表面張力進(jìn)行間接評(píng)估。該儀器基于朗繆爾單層原理，通過測量氣液界面吸附膜的平衡表面壓力來反映膜材料的表面張力特性。

樣品準(zhǔn)備與測量：

對(duì)數(shù)生長期的NRK細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌兩次。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度，制備成單細(xì)胞懸液。將含有細(xì)胞骨架蛋白抑制劑（CD、blebbistatin或其組合）的處理組細(xì)胞懸液及未經(jīng)處理的對(duì)照組細(xì)胞懸液分別上樣至儀器樣品板。

測量過程：

儀器自動(dòng)監(jiān)測氣液界面的表面壓力變化。細(xì)胞在界面處發(fā)生吸附并形成單層膜，其膜脂與皮層蛋白的力學(xué)特性會(huì)影響界面的平衡表面壓力（π平衡）。細(xì)胞膜的表面張力（γ細(xì)胞膜）可通過公式γ細(xì)胞膜=γ_0-π平衡進(jìn)行估算，其中γ_0為純培養(yǎng)基的表面張力（約為72 mN/m）。儀器自動(dòng)記錄達(dá)到平衡后的表面壓力值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少6次。

1.4細(xì)胞間橋的測量和細(xì)胞間橋動(dòng)力學(xué)模型

定義間橋直徑與間橋長度相等時(shí)刻的相對(duì)直徑為1，其它各時(shí)刻的相對(duì)直徑等于各時(shí)間點(diǎn)間橋直徑與上述直徑絕對(duì)值的比，對(duì)間橋直徑進(jìn)行無量綱化。規(guī)定間橋直徑與間橋長度相等時(shí)的時(shí)刻為0 s，則所有曲線均過(0,1)點(diǎn)，定義(0,1)點(diǎn)為D?(見圖2)，使曲線更具有直觀性和可比性。對(duì)表觀速度進(jìn)行如下規(guī)定：D?之前的表觀速度為間橋直徑在-200~0 s時(shí)間段的速度；D?之后的表觀速度為間橋直徑在0～200 s時(shí)間段的速度。

圖2 NRK細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)隨時(shí)間變化曲線

實(shí)驗(yàn)采用間橋變細(xì)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)間橋變形進(jìn)行分析和模擬，見圖3。該模型認(rèn)為：肌球蛋白II所產(chǎn)生的徑向應(yīng)力為主動(dòng)力，促進(jìn)胞漿從間橋向兩個(gè)子細(xì)胞流動(dòng)；間橋末端以及子細(xì)胞胞漿黏性產(chǎn)生的軸向應(yīng)力為被動(dòng)力，阻礙胞漿從間橋向兩個(gè)子細(xì)胞流動(dòng)。間橋半徑隨時(shí)間變化的函數(shù)表達(dá)式為：

1.5數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用微管吸吮測量細(xì)胞表面張力，采用100倍物鏡，10倍目鏡；對(duì)細(xì)胞形態(tài)變形進(jìn)行測量實(shí)驗(yàn)，采用40倍物鏡，10倍目鏡，兩者均通過中繼放大50%。圖像采集均通過冷CCD(DP71，Olympus)進(jìn)行圖像采集，間隔4 s取像。采用圖像處理軟件(Image Pro 5.1，Olympus)進(jìn)行形態(tài)學(xué)測量。不同細(xì)胞組數(shù)據(jù)用OriginPro 8.0處理，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件及方差分析比較組間差異，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。